簡(jiǎn)要描述：外泌體膜含有分泌細(xì)胞來源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其中，磷脂酰s氨酸（PS），目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶的作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但是，它也暴露在外泌體膜的外側(cè)3）。Tim4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4）是凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞吞噬受體。在鈣離子存在下，Tim4通過與胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合到PS 4
產(chǎn)品型號(hào)
廠商性質(zhì)
更新時(shí)間
瀏覽次數(shù)
產(chǎn)品分類
| 品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 一個(gè)月 |
|---|
使用磷脂酰si氨酸和Tim4的新型外泌體純化法：PS親和法
外泌體膜含有分泌細(xì)胞來源蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，其中，磷脂酰si氨酸（PS），目前普遍認(rèn)為在活細(xì)胞中通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶的作用定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但是，它也暴露在外泌體膜的外側(cè)3）。Tim4（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4）是凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞吞噬受體。在鈣離子存在下，Tim4通過與胞外區(qū)的IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合到PS 4）。
以上述知識(shí)作為參考，我們利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕獲培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體，并通過添加螯合劑即可純化外泌體，這種劃時(shí)代的外泌體純化方法是由FUJIFILM Wako和金澤大學(xué)納米生命科學(xué)研究所的華山教授共同開發(fā)并取得了成功5）。
與傳統(tǒng)的外泌體純化法相比，外泌體純化試劑盒“MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2"可實(shí)現(xiàn)更加簡(jiǎn)單地純化完整狀態(tài)的高純度外泌體。這是可取代迄今為止的黃金標(biāo)準(zhǔn)法超速離心法的新型外泌體純化法。
利用磷脂酰si氨酸（PS）結(jié)合分子以金屬離子依賴性方式捕獲細(xì)胞外囊泡，并通過螯合劑洗脫。
◆利用PS親和法提取和分離細(xì)胞外囊泡（外泌體）
采用新型親和純化法 ● 使用PS親和分子回收※ ● 低背景 ● 在中性條件下利用螯合劑溫和洗脫
分離高純度完整的外泌體 | 無需進(jìn)行超速離心 ● 使用磁珠提高操作性 ● 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)protocol
實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)性高 |
和其他純化方法的比較
方法 | 純度 | 外泌體回收量 | 獲得完整粒子 | 總蛋白量 |
MagCapture™（PS親和法） | ■ ■ ■ ■ | ■ ■ ■ | ○ | ■ |
超速離心法 | ■ ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ ■ |
聚合物沉淀法 | ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ ■ ■ |
密度梯度離心法 | ■ ■ ■ | ■ | ○ | ■ ■ |
尺寸排阻法 | ■ ■ ■ | ■ ■ | ○ | ■ ■ |
表面抗原親和法 (使用抗體) | ■ ■ ■ | ■ ■ | × | No data |
※ 本表格根據(jù)FUJIFILM Wako自行調(diào)查的結(jié)果制成。表中結(jié)果可能因樣品、檢測(cè)對(duì)象與方法的不同而有所差異,無法保證以上各方法的性能。
◆MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS Ver.2：PS親和法x磁珠
該試劑盒可從細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿等樣品中高純度且簡(jiǎn)便快捷地純化外泌體等細(xì)胞外囊泡。通過應(yīng)用以鈣離子依賴方式與細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰si氨酸（PS）結(jié)合的Tim4，并使用螯合劑實(shí)現(xiàn)完整的細(xì)胞外囊泡純化。
特點(diǎn)
● 通過新型親和法（PS親和法）可獲得高純度的細(xì)胞外囊泡
● 與傳統(tǒng)的超速離心法相比，可獲得更高回收量和純度的外泌體
● 可獲得完整的外泌體，應(yīng)用廣泛
● 磁珠操作簡(jiǎn)便，可處理多個(gè)樣品
操作流程
試劑盒組成
2 tests | 10tests | |
Biotin Capture Magnetic Beads | 120 μL | 600 μL |
Biotin-labeled Exosome Capture | 20 μL | 100 μL |
Exosome Immobilizing / Washing Buffer (10×) | 5 mL | 25 mL |
Exosome Binding Enhancer (500×) | 300 μL | 1500 μL |
Exosome Elution Buffer (10×) | 300 μL | 1500 μL |
Reaction Tubes | 4支 | 22支 |
◆PS親和法提取純化外泌體的應(yīng)用數(shù)據(jù)合集
使用PS親和法提取和純化外泌體的性能數(shù)據(jù)。
1. 從培養(yǎng)上清樣品純化的細(xì)胞外囊泡性能數(shù)據(jù)
2. 從血清、血漿、尿液樣品純化的細(xì)胞外囊泡性能數(shù)據(jù)
3. 與傳統(tǒng)沉淀法的性能比較
4. 健康人血清來源外泌體的miRNA和mRNA的回收量比較
5. 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
6. 使用Protein Assay BCA Kit定量外泌體的蛋白濃度
7. 外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)
1. 從培養(yǎng)上清樣品純化的細(xì)胞外囊泡的性能數(shù)據(jù)
使用透射電子顯微鏡對(duì)PS親和法和超速離心法分離的外泌體進(jìn)行分析。
①本試劑盒純化的樣品
樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清10 mL
粒子數(shù)：3.69×1010 particles/mL
②超速離心法純化的樣品
樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清10 mL
粒子數(shù)：1.68×1010 particles/mL
與超速離心法相比，PS親和法分離的外泌體可觀察到多約100 nm的囊泡，且雜質(zhì)少。
2. 從血清、血漿、尿液樣品純化的細(xì)胞外囊泡的性能數(shù)據(jù)
從人血清提取的外泌體回收量比較
使用本試劑盒、超速離心法和表面抗原抗體親和法從1 mL的人血清樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot（抗CD9抗體和抗CD63 抗體）。
| 泳道1：超速離心法 泳道2：PS親和法 泳道3：A公司外泌體提取試劑盒（CD9） 泳道4：A公司外泌體提取試劑盒（CD63） 泳道5：A公司外泌體提取試劑盒（CD81） 泳道6：A公司外泌體提取試劑盒（CD9、CD63、CD81和EpCAM抗體磁珠混合物） |
WB數(shù)據(jù)：每個(gè)樣本結(jié)果對(duì)應(yīng)150 μL的血清樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。
結(jié)果：與超速離心法和抗體親和法相比，PS親和法的外泌體回收率更高。
從人EDTA血漿樣品中分離外泌體
分別從１mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot （抗 Flotillin2 抗體）。
| 泳道1：EDTA血漿 泳道2：EDTA血漿（超濾更換緩沖液） 泳道3：血清 檢測(cè)抗體：抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience 使用樣品量：各１mL WB數(shù)據(jù)：每個(gè)樣本結(jié)果對(duì)應(yīng)150 μL血清樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。 結(jié)果：通過超濾更換緩沖液后，可以更高效地回收外泌體。 |
從人尿液樣品中分離的外泌體回收量比較
使用本試劑盒、聚合物沉淀法和超速離心法從1 mL尿液樣品中提取外泌體，并進(jìn)行Western blot。
標(biāo)記蛋白回收量比較
| 泳道1：聚合物沉淀法 泳道2：超速離心法 泳道3：PS親和法
檢測(cè)抗體：抗 CD9 兔多抗（System Biosciences） 使用樣品量：各１mL WB數(shù)據(jù)：每個(gè)樣本結(jié)果對(duì)應(yīng)150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，添加５μL的 4×SDS 樣品緩沖液，全部上樣。 |
|
|
|
Size Distribution Mean: 176 +/- 1.6 nm | Size Distribution Mean: 191 +/- 9.4 nm | Size Distribution Mean: 107 +/- 1.2 nm |
結(jié)果：從尿液樣品中也可以高純度提取外泌體。
3. 與傳統(tǒng)沉淀法的性能比較
分別用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘?xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）提取外泌體，比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。
PS 親和法：按照試劑盒的Protocol（反應(yīng)時(shí)間：3 h），從1 mL經(jīng)離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）中提取外泌體。
超速離心法：將10 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進(jìn)行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。
聚合物沉淀法：從1 mL經(jīng)過離心處理（10,000×g，30 min）的 K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或 10% Exosome-depleted FBS 添加培養(yǎng)基）中，按照市售的A公司產(chǎn)品的操作說明（靜置時(shí)間：過夜）提取外泌體。
比較提取的外泌體的電子顯微鏡分析結(jié)果和納米粒子追蹤（NTA）分析結(jié)果
分別用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清提取外泌體，用NTA LM-10 檢測(cè)外泌體的粒子直徑。另外，用最終濃度為２%的多聚甲醛固定提取到的外泌體（２~4×1010 particles），使用電子顯微鏡進(jìn)行分析。
電子顯微鏡圖像 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生
結(jié)果：MagCapture™（PS親和法）可提取約100 nm 的粒子，在電子顯微鏡中也可以確認(rèn)到大量的細(xì)胞外囊泡。
K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）提取的外泌體回收量和純度的比較
使用本試劑盒、超速離心法和聚合物沉淀法從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）提取外泌體并進(jìn)行電泳，再使用銀染色和 WB 法（抗CD63抗體、抗Flotilin-2抗體和抗Lamp-1 抗體）進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果：銀染色結(jié)果顯示，與MagCapture™（PS親和法）相比，超速離心法和聚合物沉淀法可提取更多外泌體。但是，WB法顯示，只有MagCapture™ 外泌體提取試劑盒可檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白條帶。
由此可知，MagCapture™ 外泌體提取試劑盒可提取更高純度的外泌體。
K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（10% FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體的回收量和純度的比較
使用本試劑盒 、超速離心法和聚合物沉淀法，從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（10%去外泌體FBS 添加培養(yǎng)基）提取樣品進(jìn)行電泳，再用銀染法和WB法（抗CD63抗體、抗Flotilin-2抗體和抗Lamp-1 抗體）進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)外泌體提取片段進(jìn)行質(zhì)譜分析，比較所有分析的多肽中K562細(xì)胞來源的人多肽的比例（添加至培養(yǎng)基的FBS來源牛蛋白聚集體混入，會(huì)導(dǎo)致人來源多肽比例下降）。
質(zhì)譜分析 數(shù)據(jù)提供：金澤大學(xué) 醫(yī)學(xué)系 華山教授、大阪大學(xué) iFReC 中井先生
結(jié)果：使用MagCapture™（PS親和法）可從FBS培養(yǎng)基中提取高純度外泌體，因此在低背景時(shí)也可進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
4. 健康人血清來源外泌體的miRNA和mRNA的回收量比較
比較從不同方法制備的外泌體中microRNA和mRNA的回收量
使用超離法和PS親和法從健康人血清中分離外泌體后，再使用microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)295-71701）提取RNA。通過定量PCR法比較microRNA量（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）和mRNA量（GAPDH, PIK3CB）的Ct 值。
結(jié)果：與超離法相比，PS親和法提取外泌體中的microRNA和mRNA的效率更高。
使用PS親和法從健康人血清中分離外泌體，再使用 microRNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)295-71701）或使用AGPC 法提取RNA。通過定量PCR法比較microRNA量（let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p）和mRNA量（GAPDH, PIK3CB）的Ct值。
結(jié)果：與AGPC法相比，使用microRNA提取試劑盒提取外泌體中的microRNA和mRNA的效率更高。
5. 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果
分別使用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法，從K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（添加10%去外泌體FBS的培養(yǎng)基）中純化外泌體。純化的樣品通過 10% SDS-PAGE電泳分離，切下全部蛋白條帶。然后進(jìn)行膠內(nèi)消化，用液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）鑒定蛋白。比較上述三種方法純化的外泌 體（n=3）中檢測(cè)蛋白的成對(duì)相關(guān)性。
鑒定的蛋白含量qian10的蛋白
白色柱：外泌體來源人蛋白
灰色柱：牛血清來源牛蛋白
紅 色：外泌體標(biāo)記蛋白
樣品：K562 細(xì)胞培養(yǎng)上清（10%已去除外泌體的培養(yǎng)基）
PS親和法 | 超離心 | 聚合物沉淀法 | |
1 | 71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein) | DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) | 補(bǔ)體C3 (Complement C3) |
2 | 膜聯(lián)蛋白A6 (Annexin A6) | 鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) | α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin) |
3 | 鐵轉(zhuǎn)蛋白受體１ (Transferrin receptor protein1) | 血清白蛋白 (Serum albumin) | 纖連蛋白 (Fibronectin) |
4 | V-ATP酶A亞基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A) | ATP依賴RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A) | 血清白蛋白 (Serum albumin) |
5 | 浮艦蛋白-2 (Flotillin-2) | 微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain) | 血小板反應(yīng)蛋白-1 (Thrombospondin-1) |
6 | 程序性細(xì)胞死亡６互作蛋白 (Programmed cell death 6-interacting protein) | 71 kDa熱休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71 kDa protein) | 補(bǔ)體C4 (Complement C4) |
7 | 細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain ) | 脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase) | α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase) |
8 | 膜聯(lián)蛋白A1 (Annexin A1) | 細(xì)胞表面抗原4F2重鏈 (4F2 cell-surface antigen heavy chain) | 載脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100) |
9 | 220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa) | U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase) | 胎兒血紅蛋白亞單位 (Hemoglobin fetal subunit beta) |
10 | 膜聯(lián)蛋白A2 (Annexin A2) | β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain) | β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain) |
結(jié)果：聚合物沉淀法中混入了牛血清來源蛋白，與之相比，PS親和法檢測(cè)出了更多的標(biāo)記蛋白。
| 樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)上清(10% 去外泌體FBS培養(yǎng)基)
參考文獻(xiàn)：Sci Rep. 2016 Sep 23;6:33935. Nakai W et al. |
同種方法的相關(guān)性：PS親和法和聚合物法較高，超離法稍低，
不同方法的相關(guān)性：較低，各種提取方法獲得的外泌體亞群可能不同。
6. 使用Protein Assay BCA Kit定量外泌體的蛋白濃度
Protein Assay BCA Kit 是使用二辛可寧酸（BCA）定量檢測(cè)溶液中蛋白質(zhì)濃度的試劑盒，是蛋白質(zhì)定量檢測(cè)法中常用的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質(zhì)Cu2+ 離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡(luò)合物，產(chǎn)生紫色螯合物，紫色螯合物顏色與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)，因此通過測(cè)定562 nm 處的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可定量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。
使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，并通過Protein Assay BCA Kit高靈敏檢測(cè)外泌體中的蛋白質(zhì)濃度。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果
將MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中，添加200 μL的Protein Assay BCA Kit 中試劑Ａ和試劑Ｂ的混合液。然后60℃孵育30 min，檢測(cè)560 nm 處的吸光度（圖1）。結(jié)果表明，通過 Protein Assay BCA Kit 的高靈敏度檢測(cè)，可檢測(cè)純化外泌體中的蛋白質(zhì)濃度。
外泌體蛋白質(zhì)濃度非常低，因此BCA檢測(cè)時(shí)無需稀釋樣品。
①將 BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液按照 250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL 和空白對(duì)照，分別每孔 25 μL添加至96 孔板中。
②分別把純化的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔 25 μL添加至96 孔板。
③將200 μL Protein Assay BCA Kit（產(chǎn)品編號(hào)：297-73101）的試劑Ａ和試劑Ｂ混合液（Ａ﹕Ｂ=50﹕1）添加至孔板中。
④60℃孵育30 min。
⑤室溫下冷卻孔板。
⑥檢測(cè)560 nm處的吸光度。
7. 外泌體的標(biāo)記和Hela細(xì)胞攝入實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)概要
使用PKH67（Sigma）標(biāo)記 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）純化的外泌體，確認(rèn)是否可導(dǎo)入Hela 細(xì)胞。
PKH67標(biāo)記外泌體
1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）純化外泌體（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化外泌體）。
※ 在步驟6-7的凝膠過濾步驟中，為了減少標(biāo)記樣品的吸附損失，建議向試劑盒附帶的洗脫液中添加EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent來制備樣品。
2. 用BCA Assay和NanoSight檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度和粒子濃度。
3. 將外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
※ 本次使用相當(dāng)于3 μg蛋白量的外泌體，請(qǐng)制備標(biāo)記所需的外泌體量。
4. 將2.0 μL的PKH linker 溶解在0.25 mL 的 DiluentC （PKH67試劑盒隨附）中。…4×Dye solution※
※ 請(qǐng)制備標(biāo)記所需的使用量。
5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育 5-10 min。
6. 根據(jù)隨附的使用說明書用PBS平衡 Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo ：#4484449）。
7. 將100 μL樣品分別添加至上述平衡后的旋轉(zhuǎn)柱※中，750×g離心2 min。
※ 旋轉(zhuǎn)柱的最大添加量為100 μL，因此樣品量超過100μL時(shí)請(qǐng)準(zhǔn)備所需支數(shù)。
8. 將外泌體溶液※添加至已經(jīng)接種好Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24 h后用顯微鏡觀察并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
※ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)外泌體添加量
顯微鏡觀察結(jié)果 | 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 |
|
|
圖1. PKH67標(biāo)記外泌體的攝入觀察
關(guān)于使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（PS親和法）分離COLO201來源外泌體樣品（總蛋白量3 μg，粒子數(shù)1×1010個(gè)），使用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit （Sigma）進(jìn)行標(biāo)記后，可在熒光顯微鏡（左）和流式細(xì)胞儀（右）中確認(rèn)到Hela細(xì)胞的攝入。
結(jié)果：在顯微鏡和流式細(xì)胞儀中都能可確認(rèn)PKH67標(biāo)記的外泌體通過胞吞作用被捕獲。此外添加EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent的樣品在去除Dye時(shí)，可極大減少凝膠過濾的吸附損失。
◆各樣品的前處理Protocol
本流程是樣品前處理的步驟。想提取外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（微泡）時(shí)，請(qǐng)按照下述Protocol對(duì)樣品進(jìn)行 1,200×g 離心操作※1，如果要提取更高純度的外泌體，則按照下述Protocol對(duì)樣品進(jìn)行10,000×g 離心操作※2。
下文是細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的前處理方法。其他體液樣品的前處理操作，請(qǐng)參考血清/血漿的Protocol，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
※1 提取外泌體+Large EVs時(shí)，請(qǐng)使用1,200xg上清作為純化用樣品。
※2 提取外泌體時(shí)，請(qǐng)使用10,000xg上清作為純化用樣品。
※3 提取Large EVs時(shí)，將10,000xg 離心所得的沉淀，用TBS重懸后作為樣品。
※4 濃縮步驟是以大規(guī)模(~50 mL)的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為純化用樣品，是選擇性的操作步驟。但由于該步驟可提高回收效率，因此請(qǐng)盡可能進(jìn)行該步驟。
※5 EV-Save™ 含有聚合物，因此不建議用作蛋白質(zhì)組學(xué)分析的樣品。
大量或少量樣品時(shí)的注意點(diǎn)
大量樣品
從大規(guī)模（~50 mL）的細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化外泌體時(shí)，推薦濃縮操作。因其可提高回收效率，，請(qǐng)盡可能進(jìn)行該操作。
少量樣品
樣品體積低于0.5 mL時(shí)，使用旋轉(zhuǎn)裝置無法有效混勻Exosome Capture固化磁珠和樣品，因此請(qǐng)根據(jù)需求添加TBS緩沖液，將樣品體積擴(kuò)增至0.5 mL以上。（例：100 ?200 μL → 500 μL）
參考數(shù)據(jù)：外泌體和Large EVs的NTA分析
準(zhǔn)備了1 mL用莫能菌素鈉促進(jìn)外泌體分泌的K562細(xì)胞培養(yǎng)上清，并從中制備10,000 x g離心后的上清樣品和10,000 x g沉淀樣品（使用1 mL TBS重懸）。
再使用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒從兩個(gè)樣品中純化細(xì)胞外囊泡，并進(jìn)行NanoSight LM10分析。
◆Ver.2和舊款的不同
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號(hào)：290-84103）は、MagCapture™ 外泌體提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：293-77601，舊款）的改良版。
1. 外泌體回收效率提高
→相同操作下，可提取更多的外泌體！
2. 可大幅度縮短操作時(shí)間
→1 h即可完成和樣品的親和反應(yīng)?。ㄅf款需要3 h）
3. 改善細(xì)胞毒性
→降低洗脫緩沖液的細(xì)胞毒性
試劑盒 | MagCapture™ 外泌體提取試劑盒Ver.2 | （舊款）MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 |
外泌體提取性能 | 培養(yǎng)上清：■■■■ 血液樣品：■■■■ | 培養(yǎng)上清：■■■ 血液樣品：■■■ |
樣品反應(yīng)時(shí)間※1 | 1 h以上 | 3 h以上 |
磁珠可再利用次數(shù)※2 | 5次 | 5次 |
洗脫緩沖液的細(xì)胞毒性 | 低※3 | 因細(xì)胞種類不同 |
※1 因樣品體積而異。
※2 使用總次數(shù)設(shè)定為5次，包括第一次使用1次，重復(fù)使用4次。提取樣品的來源不同，考慮污染風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，推薦使用新調(diào)配的磁珠。
※3 請(qǐng)勿更換洗脫樣品的緩沖液，可用于In Vitro和In Vivo的給藥實(shí)驗(yàn)。洗脫緩沖液的EDTA出現(xiàn)問題時(shí)，需要更換緩沖液。
外泌體回收率的比較（血清和血漿）
外泌體回收率的比較（間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)上清）
純化外泌體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)
1. 外泌體的回收率比較（血清和血漿）
使用MagCapture™外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號(hào)：290-84103）和舊款試劑盒從各種人血液樣品中分離純化外泌體（EV）。對(duì)獲得的外泌體，
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
③通過NTA進(jìn)行粒子數(shù)測(cè)定
再將試劑盒附帶的洗脫緩沖液按照常規(guī)的Protocol稀釋成“1x Elution buffer（1xEB）"，并和5倍稀釋的“2xElution buffer（2xEB）"進(jìn)行比較。
結(jié)果顯示，Ver.2試劑盒表現(xiàn)出與舊款試劑盒相當(dāng)或更優(yōu)的性能。特別是使用2xElution Buffer時(shí)，血漿樣品的回收效率顯著提升。
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
檢測(cè)抗體：
抗CD9，大鼠單克隆抗體（77B）（產(chǎn)品編號(hào)： 019-28173）
抗CD63，單克隆抗體（3-13）（產(chǎn)品編號(hào)：012-27063）
抗Flotillin2，單克隆抗體（BD Biosciences）
2. 外泌體回收率比較（間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)上清）
使用MagCapture™外泌體提取試劑盒Ver.2（產(chǎn)品編號(hào)：290-84103）和舊款試劑盒從MSC培養(yǎng)上清中提取純化外泌體（EV）。對(duì)獲得的外泌體，
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
③通過NTA進(jìn)行粒子數(shù)測(cè)定
結(jié)果顯示，舊款試劑盒相比Ver.2試劑盒回收效率更高。
①使用PS Capture™外泌體ELISA試劑盒比較EV標(biāo)志物
②通過Western blot比較EV標(biāo)志物
3. 純化外泌體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)
分別使用舊款試劑盒和Ver.2試劑盒從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離和純化EV，再將等量的洗脫樣品和對(duì)照洗脫緩沖液添加至提前接種的人正常成纖維細(xì)胞中，48 h后檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化。
結(jié)果顯示，舊款試劑盒在添加Elution buffer和純化外泌體48 h后，出現(xiàn)了細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而使用Ver.2試劑盒時(shí)未觀察到顯著的細(xì)胞死亡。Ver.2試劑盒改善了舊款試劑盒存在的細(xì)胞毒性問題，因此無需更換Elution buffer即可用于In Vitro及In Vivo給藥實(shí)驗(yàn)。
※ 若Elution buffer的EDTA出現(xiàn)問題時(shí)，需要更換緩沖液。
點(diǎn)擊此處查看相關(guān)視頻：MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 294-84101 | MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2 | 2次用 | 基因研究用 | |
| 290-84103 | MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2 | 10次用 | 基因研究用 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 290-80301 | PS Capture(TM) Exosome Isolation Resin Kit PS Capture™外泌體提取樹脂試劑盒 | 1 Kit | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 297-79201 | PS Capture(TM) Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) PS Capture™外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 298-80601 | PS Capture(TM) Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) PS Capture™外泌體ELISA Kit （鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 296-83701 | CD9-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD9-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 290-83601 | CD63-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD63-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 292-83801 | CD81-Capture Human Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) CD81-Capture 人外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 297-79701 | PS Capture(TM) Exosome Flow Cytometry Kit PS Capture™外泌體流式試劑盒 | 96 tests | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 012-27063 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 抗CD63單抗（3-13） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 014-27643 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Fluorescein Conjugated 抗CD63，單克隆抗體（3-13），熒光素結(jié)合 | 100 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 019-27713 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Biotin Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），sheng物素偶聯(lián) | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 011-27751 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Red Fluorochrome(635) Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），紅色熒光染料（635）偶聯(lián) | 25 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 017-27753 | Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13), Red Fluorochrome(635) Conjugated 抗CD63單克隆抗體（3-13），紅色熒光染料（635）偶聯(lián) | 100 tests | 免疫化學(xué)用 | - |
| 014-27763 | Anti CD9, Monoclonal Antibody (1K) 抗CD9單克隆抗體（1K） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 011-27773 | Anti CD81, Monoclonal Antibody (17B1) 抗CD81單克隆抗體（17B1） | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 013-27951 | Anti CD9, Rat Monoclonal Antibody (30B) , Biotin Conjugated 抗CD9，大鼠單克隆抗體（30B），sheng物素標(biāo)記 | 20 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 019-27953 | Anti CD9, Rat Monoclonal Antibody (30B) , Biotin Conjugated 抗CD9，大鼠單克隆抗體（30B），sheng物素標(biāo)記 | 100 μL | 免疫化學(xué)用 | - |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 058-09261 | EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent EV-Save™ 細(xì)胞外囊泡保存穩(wěn)定劑（超濾用） | 1 mL | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 081-10261 | Human TIM4/Human Fc Chimera, recombinant 人Tim4/人Fc嵌合體，重組 | 100 μg | 基因研究用 | - |
| 137-18511 | Mouse TIM4/Human Fc Chimera, recombinant 鼠標(biāo)TIM4/人Fc嵌合體，重組 | 100 μg | 基因研究用 | - |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 299-36421 | MAGNET STAND MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架 | 1個(gè) | - | - |
技術(shù)文章
上一篇
